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TA克隆(TAcloning)是一種免用限制酶的亞克隆手段,其操作不僅比傳統的亞克隆簡單,而且耗時也較短。TA克隆的關鍵在於載體和目的基因末端的腺嘌呤(A)和胸腺 ...
TA克隆(TA cloning)是一種免用限制酶的亞克隆手段[1],其操作不僅比傳統的亞克隆簡單,而且耗時也較短。TA克隆的關鍵在於載體和目的基因末端的腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的互補配對。載體和目的基因進行上述配對之後,用DNA連接酶即可實現它們之間的共價連接。
TA克隆的圖示 製造目的基因 編輯一般用PCR來製造目的基因。PCR中所用的Taq酶無3-5端外切活性,容易在3端額外加上一個腺嘌呤(A)。因而PCR產物兩條鏈3端一般都多出一個腺嘌呤。如果PCR引物的5端含有鳥嘌呤(G)的話,能使得3端加上腺嘌呤的機率最大化[2]。值得注意的是,製造用於TA克隆的目的基因的DNA聚合酶不能有3-5外切活性,否則產物的3端不會多出一個額外的腺嘌呤[3]。
製造載體 編輯首先,將想要使用的載體用能產生平滑末端的限制酶線性化。之後,用末端轉移酶在其末端加上一個2,3-雙脫氧三磷酸胸苷(ddTTP)。使用ddTTP才能確保只在末端加上一個胸腺嘧啶殘基。胸腺嘧啶殘基會被加到3端上[4]。一般市面上的TA克隆試劑盒中會附有一系列的可直接用於TA克隆(即3端有一個額外的胸腺嘧啶)的載體。
TA克隆中除了切開載體之外,都不需要使用限制酶,因而其操作相比傳統亞克隆手段更簡單快速。實驗者也沒有必要在設計引物的時候加上限制酶位點,因而節約了時間和金錢。另外,如果因爲沒有合適的酶切位點而無法進行傳統的亞克隆時,TA克隆就可以作爲一種替代方案。TA克隆的主要缺陷在於目的基因有50%的概率以相反方向被植入載體中[1]。此外,通常情況中,TA克隆中的目的基因末端會多出一個腺嘌呤,而載體末端會多出一個胸腺嘧啶。
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